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RISULTATI CONSEGUITI al 28/02/2013
Per la filiera lattiero casearia è stato condotto un monitoraggio del degrado quali e quantitativo della frazione proteica e della porzione grassa dei campioni di latte e di siero bovino oltre la loro data di scadenza, al fine di stabilire una finestra temporale entro la quale poter recuperare molecole potenzialmente attive.
In particolare l’attenzione è stata focalizzata su:
• lipidi;
• caseine;
• sieroproteine;
• riboflavina.
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Frazione grassa
Le analisi della frazione lipidica effettuata su campioni di latte commerciale scremato, parzialmente scremato ed intero a diverse settimane dalla loro data di scadenza, hanno evidenziato una progressiva diminuzione della quantità di acidi grassi insaturi in funzione del tempo; da questi risultati si è evinto che il tempo di esposizione dei campioni all’ossigeno atmosferico è un fattore determinante per la degradazione di acidi grassi. Contrariamente alla degradazione degli acidi grassi, invece, l'idrolisi dei trigliceridi, catalizzata dalle lipasi presenti nei campioni di latte, è un processo indipendente dal tempo, ma fortemente condizionato dai valori di pH e di acidità titolabile (TA).
La correlazione esistente tra il TA e l’attività lipasica totale fornisce dati più significativi rispetto alle informazioni ottenute dai semplici valori di pH. Il pH, difatti, esprime solo la concentrazione di ioni idrogeno presenti in soluzione, mentre l'acidità titolabile è influenzata da diversi parametri, come le funzioni acide delle caseine, la presenza di acidi organici ed inorganici e dei sali minerali. Risulta quindi chiaro dedurre che: le informazioni che possono essere ottenute sull’attività lipolitica del latte da una singola misurazione del pH, sono abbastanza soddisfacenti mentre, la determinazione dell’acidità titolabile totale, fornisce una descrizione più dettagliata dei cambiamenti che si verificano nel latte durante il periodo di fermentazione, essa dunque risulta essere un utile strumento per il monitoraggio della qualità e della conservazione del latte bovino. | | | | | Frazione caseinica
Completamente differente è invece la degradazione della frazione proteica caseinica. L’alterazione della struttura globulare micellare dovuta alla degradazione enzimatica, ha reso particolarmente difficoltosa la sua caratterizzazione qualitativa. Per questo è stato necessario lo sviluppo, in collaborazione con il Prof. Francesco Gasparrini, di apposite colonne monolitiche capillari in grado di aumentare, in maniera significativa, la sensibilità e la risoluzione delle frazioni proteiche, estratte dai campioni di latte oltre la loro data di scadenza. Lo sviluppo di un metodo cromatografico che permetta una completa identificazione e quantificazione di ciascun componente della frazione caseinica, quindi, permetterebbe di conoscere le proprietà biochimiche e biologiche dei campioni di latte, ed un loro possibile impiego sia nella dieta che nella formulazione di nutraceutici. Di seguito si riporta un profilo cromatografico della frazione caseinica estratta da campioni di latte totalmente scremato a diverse settimane dalla data di scadenza utilizzando una colonna capillare monolitica Protein_Cap_RP_Lauryl_γ_Monolithic (250 x 0.250 mm L. x I.D.). | 
| Frazione Sieroproteica
Questa fase pone come principali obiettivi il recupero e la valutazione biologica, sia dei peptidi generati dall’idrolisi enzimatica di molecole proteiche progenitrici nei campioni di latte in fase di degradazione, sia dei peptidi formatisi in seguito alle diverse fasi di lavorazione del siero.
Di seguito sono mostrati i dati biologici preliminari effettuati su cellule Caco 2 pre confluenti trattate per 48h con 0.5μg di peptidi <3000Da e 10000-3000Da generati nei campioni di latte oltre la loro data di scadenza. |  | Riboflavina
La rimozione della Vitamina B2 dal siero e dai campioni di latte scaduto è finalizzata ad evitare interferenze nei saggi biologici con i peptidi di nostro interesse.
In questa fase è stato messo a punto un metodo rapido, selettivo e poco costoso, che permette l’estrazione della riboflavina dal siero mediante l’adsorbimento della stessa su una resina di natura polimerica Amberlite XAD-2.
Le figure di seguito riportate mostrano, in nero, il profilo cromatografico delle siero proteine e dei peptidi generati dall’idrolisi enzimatica presenti nel campione di latte intero dopo due settimane dalla data di scadenza. In viola, invece, è evidenziato il cromatogramma della Riboflavina, prima (Fig. 3) e dopo (fig. 4) il trattamento del campione in esame con la resina Amberlite XAD-2.
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Obiettivo finale di questa fase è lo studio e lo sviluppo formulativo di prodotti cosmetici e nutraceutici a base di olio d’oliva e di estratti dai prodotti di scarto della lavorazione dell’olio. Sono state messe a punto formulazioni cosmetiche contenenti alte concentrazioni di olio extravergine di oliva; emulsioni sviluppate come crema viso idratante, crema viso antirughe, crema mani ed olio per il corpo idratanti, contenenti dal 3 al 5% di olio di oliva extravergine, fornito da AGRIOIL, ed è stato inoltre, sviluppato un protocollo standard di valutazione della stabilità del cosmetico finito. E’ stata messa a punto una formulazione crema viso idratante e anti-aging a base olio di oliva nella quale sono stati incorporati ulteriori principi dermofunzionali idratanti e antirughe e modificato il sistema conservante. Le formulazioni cosmetiche che presentano un elevato contenuto di olii possono dare una spiacevole percezione “oleosa” nella fase di applicazione sulla pelle che è un effetto non gradito in cosmetica, per tale motivo è stato incorporato un attivo “anti-grasso” (un amido modificato) con funzioni adsorbenti in grado di migliorare lo skeen-feeling e limitare l’effetto “unto” tipico degli olii, donando anche un tocco setoso alla formulazione. Inoltre, questi attivi assorbono anche l’eccesso di sebo sulla pelle rendendola asciutta e meno lucida. Le formulazioni cosmetiche prodotte si presentano non untuose e di aspetto non lucido, dalla texture fresca e leggera. Si assorbono rapidamente, lasciando la pelle setosa. Le emulsioni sono omogenee, stabili e senza significative variazioni nel periodo dei test di invecchiamento.
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Questa fase è articolata in diversi punti:
• sviluppo di metodiche analitiche fast;
• recupero di principi attivi presenti negli scarti agrumari;
• valutazione biologica;
• sviluppo di sistemi di veicolazione e di rilascio controllato dei bioattivi.
| Sviluppo di metodiche analitiche fast
In questa fase è stato sviluppato un metodo di analisi veloce per la caratterizzazione dei flavonoidi presenti nel Citrus Bergamia attraverso UPLC-ESI-IT-TOF. Rispetto ai convenzionali metodi HPLC per l’analisi di queste matrici, è stata ottenuta una drastica riduzione dei tempi di analisi, che ha portato prima alla separazione e poi all’identificazione di 17 composti in meno di 5 minuti.
Questo metodo mostra il potenziale del UPLC come strumento per la caratterizzazione rapida dei flavonoidi, ma al contempo evidenzia una grande versatilità che consente una sua applicazione anche ad altre matrici alimentari come l’olio e le acque di vegetazione ottenute dalla lavorazione dello stesso. |  | Sviluppo e recupero di bioattivi
La caratterizzazione degli scarti dell’industria agroalimentare ha permesso di evidenziare la presenza di numerose molecole biologicamente attive in bucce, semi e acque di lavaggio della lavorazione degli agrumi. Questo risultato porta ad indirizzare il percorso della ricerca verso l’isolamento di queste molecole dalle matrici indagate per mezzo di strumentazioni analitiche tecnologicamente avanzate. Difatti, in collaborazione con il Prof. Luigi Mondello, è stato sviluppato un sistema preparativo multidimensionale al fine di recuperare principi attivi dai reflui della lavorazione agrumaria.
|  | | Valutazione biologica
I dati preliminari effettuati sugli estratti liofilizzati di Citrus, confermano che il succo di bergamotto presenta una discreta proprietà antiossidante già rilevata mediante i test in vitro e riproducibili anche nei test eseguiti sulle colture cellulari.
Il succo d’arancia rossa, invece, riduce la risposta infiammatoria da parte dei macrofagi stimolati con LPS. Sebbene i meccanismi sottesi a tale stimolazione richiedano ulteriori studi, la ridotta espressione ed attività di enzimi quali iNOS e COX-2, la ridotta produzione di TNF-α e di ROS contribuiscono, almeno in parte, a spiegare l’effetto anti-infiammatorio del succo d’arancia.
Con ulteriori esperimenti, restano da definire meglio le attività antiossidante ed antinfiammatorie degli estratti di Citrus e poi confrontarle con quella delle altre matrici biologiche prese in considerazione nel progetto. | Sistemi di veicolazione e di rilascio controllato
Sono stati progettazione e realizzati sistemi microparticellari (microparticelle e nano-particelle di polimeri biodegradabili e biocompatibili) per la veicolazione e il rilascio controllato del succo di bergamotto e di arancia, ovvero lo sviluppo dei prodotti (polveri microparticolate) denominati BMP e AMP. I succhi sono stati processati mediante tecnologia spray-drying, e la messa a punto di tutte le variabili di processo ha permesso di ottenere rese di produzione molto alte (90%) con un’efficienza di caricamento del succo nella matrice biopolimerica superiore al 65%. BMP e AMP presentano migliori caratteristiche organolettiche (odore e sapore), maggiore solubilità in acqua e velocità di dissoluzione nei fluidi gastro-intestinali simulati, facilità di manipolazione e dosaggio, stabilità della componente polifenolica e dell’attività biologica antiossidante rispetto al succo non processato. Di conseguenza i prodotti microincapsulati possono essere proposti sia per formulazioni a somministrazione orale che come ingredienti funzionali per prodotti cosmetici.
Le polveri AMP e BMP sono risultate adatte alla compressione diretta per la produzione di compresse. Attraverso l’ausilio di pochi eccipienti, è stato possibile aumentare ulteriormente la maneggevolezza delle polveri prodotte (miscelazione semplice) per una fase successiva di produzione semplice e rapida. E’ stato possibile formulare le compresse (BMT e AMT) con l’aggiunta di pochi ulteriori eccipienti utili a favorire il processo di compressione diretta e la disgregazione delle compresse risultanti.
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